单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （上篇）
单细胞RNA测序是目前的一大热门。通过单细胞RNA测序，能够带给我们原来 bulk RNA （群体RNA）测序所得不到的信息，对于研究发育生物学、肿瘤生物学、免疫等有着极其重要的价值。单细胞测序的核心就是T-sne降维，以及聚类。那么在做这些工作之前的质控，会影响到整个分析的成败。这篇文章我就来给大家讲讲单细胞质控的那些事儿。
首先，我们介绍转录表达中的一个现象：transcriptional bursting。什么叫做trancriptional bursting? 如下图：
我们都知道，基因的转录和表达是有周期性的。当基因的转录被激活时，mRNA的水平会突然上升，然后慢慢下降，而相应的蛋白水平的变化会有一定的滞后。
这种周期的频率，以及每次波动的大小，在RNA分析中都会影响最终的表达量（可以是FPKM值、RPKM值）。这种周期性的转录现象，就是同transcriptional bursting有关。
我们在分析RNA表达量的时候，会发现这样一个现象，很多重要转录调控因子的FPKM值往往比较低。推测可能他们只在某一特定的时间段在特定的细胞中表达。
最终，我们拿到的结果可能就与实际情况出入很大，如下图所示。
我们来看看单细胞实验的整体流程如下图，分析一下哪些环节会带来偏好性，以及如何发现和质控 。
我们在做单细胞测序的时候，首先要做细胞分离。细胞分离必须要在短时间内完成，否则会影响到细胞的状态，甚至可能导致RNA从细胞中漏出。
从组织中分离出细胞往往很困难，具体方法可以参考《Tissue Handling and Dissociation for Single-Cell RNA-Seq》这本书。这里总结一下从组织中分离出单细胞可能遇到的问题：
在a图和b图中，一些高表达的基因被证明是由细胞分离的操作引起的。(van den Brink et al. Nature methods 2017)。
在细胞分离的过程中可能存在着污染。如图所示，在d***3的样本中都存在着Neutrophil细胞的marker基因的表达。这有可能就是样本中存在着RNA的污染。
解决的方法就是利用空的droplets 来估计背景信号，利用软件SoupX来移除背景噪音（Young MD, BiorXiv 2018）。
我们在做细胞分选的过程中还会遇到如下的问题：
对于不同的单细胞测序的策略总结如下。因此，对于自己研究的组织应该采用什么样的单细胞策略，需要十分慎重。
另外，细胞质量比较差、亦或有很多死细胞或者细胞碎片的话，也会造成有很多droplet中存在多个细胞。如下图所示：有三个冻存样本有很高比列的droplet存在多个细胞。
在实际进行数据分析的过程中，这些droplet有可能会被单独聚为一类，也有可能会富集在两个细胞群的中间区域。
我们通过如下情况来判断是否存在douplet(含有多个细胞的液滴):
目前，有一系列的软件可以帮助我们筛选到doublet，例如：
检测doublet的软件算法都非常类似，基本的原理非常简单，有下面几个步骤：
在做单细胞测序的之前，需要对细胞进行裂解。不同的细胞组织，裂解条件也会不一样。如果裂解条件过于严格，就会影响文库制备。
构建文库同时加入浓度已知的spike-in，其中包括：
Spike-ins 的用途
1.去除技术噪音
2.检测捕获效率
3.计算RNA的起始量
4.数据的normalization
Spike-ins的问题
1.Spike-ins与内源基因还是有区别的，如在扩增偏好性方面
2.一般不用于drop-seq
sample Multiplexing（请参考以下网址） 很多时候并不好用。每个细胞的total reads依旧会有很大的区别。
测序过程也有可能受到很多因素的影响：
1.文库复杂性太低，容易形成primer dimer
2.污染问题，请参考：
)
本次的分享就到这里，相信大家对整体的实验有了一定了解。下一篇我们继续讲解质控方面的细节。
单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （下篇）
单细胞RNA测序是目前的一大热门。通过单细胞RNA测序，能够带给我们原来 bulk RNA 测序所得不到的信息，对于研究发育生物学，肿瘤生物学，免疫等有着极其重要的价值。
单细胞测序的核心就是t-SNE降维，以及聚类。那么在做这些工作之前的质控，关乎到整个分析的成败。这篇文章我就继续给大家讲讲单细胞质控的那些事儿。
整个单细胞分析的核心其实就是确定cell types/ lineages。而在此之前的一步就是数据质控(QC, quanlity control)。我们在得到表达矩阵之后，会做Data normalization , 基因集筛选，批次效应的去除等工作；之后用PCA， t-SNE进行降维。如果在这一过程中发现了一些问题，我们会移除掉一些细胞，然后重新质控，降维分析。
一般而言，检查点有如下一些：
比对率比较低或者reads数较少有可能是建库原因。reads数较少可能与形成较多的primer dimer有关，而比对率低通常是建库的原因。
如果spike-in RNA序列很少，那么就可以直接说明是建库失败。如果spike-in 正常，但细胞RNA序列较少，可能是因为这个细胞本身就非常小，或者细胞在建库前出现了破损。
检测出基因的数量与细胞大小直接相关。如果检测出的基因（UMI）过多，很有可能是这个droplet里面有多个细胞，但是也不能排除是这个细胞就是非常的大。如下图，基因数目过多或者过少，都是不正常的情况。
通常而言，细胞大小、spike-in RNA比例与检测出的基因数往往是正相关的，如下图。
如果线粒体RNA过高，也同样预示着细胞有破损。因为当细胞破损时，细胞质RNA会跑出来，但是线粒体RNA由于有线粒体膜的包裹，不会溢出。因此，当细胞膜有破损时，线粒体RNA所占比例会很高。注意：当细胞出现apoptosis, necrosis的时候，也会有这种现象。
核糖体RNA占比较高时，可能是因为细胞内出现了较多的RNA降解。在全长单细胞转录组中，3’ 偏好性可用于检测细胞内是否存在大量RNA降解。
在上图中，我们对细胞中基因的数量、唯一比对率、基因body比对率、spike_detection等绘制分布图，然后剔除不合格细胞，将能够通过上述所有质控标准的细胞保留下来、用于后续分析。
基于PCA这一算法也可以进行质控，找到明显没有与其他细胞聚到一起的细胞。这些细胞被认为是质控不达标的细胞，如下图所示。
我们已经有了这么多方法和指标去过滤细胞，那么我们需要注意一些什么呢？
接下来就是要讨论如何过滤基因，对于绝大多数情况，我们不会用所有的基因去进行降维分析，所以需要进行基因集合的选取。
基因集的设定是基于：
（1）表达量高于一定阈值的基因
（2）在整个细胞样本中存在差异变化的基因
（3）用先验的知识去挑选基因
（4）bulk RNA测序中已经鉴定出来的差异基因。
（5）t-SNE降维时只选取前几个PC
有些时候，有些基因的表达异常高，这对后续数据的Normalization带来影响，有时也会考虑过滤掉。比如nulcear lncRNA ,、actin,、hemoglobin,、线粒体RNA和核糖体RNA。
有一些基因要根据情况需要进行移除，以下三点要根据课题情况来决定是否保留或者去除。
单细胞RNA测序最棘手的就是批次效应（batch effect）。 batch effects 可以发生在：
不同批次的样品或许采用的质控标准也应该不一样，通过PCA的结果，可以查看结果中是否有明显的批次效应。
深度好文 | 单细胞RNA测序技术简介
文献解读
Potter, S. S. (2018).Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology anddisease. Nature Reviews Nephrology , 14 (8), 479.
人体细胞中包含大约2万个基因，每个细胞存在自身特异的基因表达模式，仅对部分基因进行表达，导致了细胞特异性的蛋白质成分和生物功能。近来单细胞测序技术的兴起，使得我们能够在单个细胞水平上研究基因的表达模式，从而能够对细胞间的异质性问题进行更精准的研究。
这篇综述出自美国俄亥俄州辛辛那提儿童医疗中心发育生物学系的Steven Potter研究员，文章主要围绕单细胞测序技术展开，包括现行单细胞测序技术的基本流程、存在问题与难点、数据处理过程，及其在生物医学领域的一些应用等。
单细胞测序技术主要包括以下流程：组织解离得到单细胞悬液，细胞裂解，RNA逆转录成cDNA，PCR扩增，高通量测序，数据分析等。
具体到操作层面上，单细胞解离主要包括三种方法：（i）人工显微操作，需要借助于显微镜和微量吸管等设备，同时人工成本较高；（ii）激光捕获显微切割（Laser capture microdissection，LCM）技术，使用激光束从冷冻组织中切割分离单个细胞；（iii）荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS），通过荧光标记将细胞群分开。FACS的方法通量较高，是目前的主流方法。细胞解离过程主要存在两个难点：（i）如何避免外在***对细胞转录产生影响。细胞内部存在早期反应基因（Early response genes）能够对外界***做出快速反应，因此解离过程中可能会发生细胞转录的变化。这个问题可以通过加入转录抑制因子，采用嗜冷性蛋白酶在冷冻条件下解离，或是仅对核RNA进行测序分析等方法进行克服；（ii）组织中可能存在一些细胞极难解离，或是十分脆弱容易破碎等，这个问题目前仍没有很好的解决方法。
解离之后的单细胞处理，包括建库和扩增，主要采用的是基于微流控（Microfluidics）技术的方法。在微流控芯片中进行细胞裂解、反转录和cDNA的扩增，之后进行测序。代表性方法是Fluidigm C1测序平台，这样的方法精度较高，成本也较高。另一种是基于微液珠（Microdroplet）的方法，将分离的单细胞与微液珠结合形成油包结构，在油包结构中进行反转录和扩增，之后进行测序。代表性方法如10X Genomics测序平台。这种方法测序通量较高，当前的测序成本大约为1美元/细胞。
单细胞测序的数据分析主要包括以下三步：（i）计算基因表达矩阵。根据测序reads上的barcode和UMI标签将reads比对到特定细胞的特定基因上并计数，以获得每个细胞中不同基因的表达量；（ii）质控。去除基因表达量很少和线粒体DNA含量较高的细胞；（iii）数据降维和聚类。通过主成分分析（Principal components ***ysis）及其他一些方法对基因表达数据进行降维，然后通过迭代性聚类分析对细胞进行分型。
单细胞测序数据中的偏差主要来自于三个方面：（i）基因表达伴有随机性。许多基因的转录并不是一个稳定的过程，而是伴有很强的随机性，其mRNA的含量也是在不断变化的；（ii）单细胞mRNA含量较低。尤其对于一些转录水平更低的基因来说，mRNA检测十分困难；（iii）反转录和扩增过程的效率较低。
单细胞测序技术的应用主要体现在三个方面：（i）细胞分化研究。借助单细胞测序以阐明同一亲本细胞如何分化产生不同类型的子代细胞；（ii）癌症发生发展研究。对肿瘤组织进行单细胞测序以对肿瘤微环境进行更加精准的刻画；（iii）其他疾病研究。对正常组织和疾病组织进行单细胞测序，以研究致病通路、鉴定新的疾病标志物以及可能的**靶标等。
生命科学单细胞测序（10×genomics技术）的原理是什么？
蓝海大脑生命科学冷冻电镜工作站研究人员表示：
单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特定细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、RNA 提取、逆转录、文库构建和测序，便可利用数据分析获得多个细胞的基因表达谱。
1.单细胞测序与普通转录组测序的区别
普通转录组使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能估计基因在细胞群中的平均表达水平，没有考虑样本中各个细胞的基因表达的异质性。无法分析早期发育组织或复杂组织的异质系统（如大脑组织等）。为克服这一限制，开发了单细胞水平的转录组测序技术（scRNA-seq）。
2.单细胞测序的原理
单细胞测序技术以单个细胞作为对象，通过对单个细胞遗传物质均匀扩增，标记建库后进行测序，最后对单个细胞基因组或转录组展开数据分析，其技术原理主要包括单细胞分离、扩增测序和数据分析3方面。
单细胞分离：主要包括荧光激活细胞分选法( flow- activated cell sorting ，FACS) 以及微流控分选法( microfluidics) 等。市场上，较成熟的商业单细胞测序公司主要有 10X Genomis 公司 的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。
3' 端文库的构建
通过10×genomics仪器将单个细胞与单个凝胶微珠通过油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下来把细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来。游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触。接着，发生逆转录反应。mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA来。
scRNA-seq 非常适合研究细胞群的异质性。例如，识别组织的细胞类型，定义不同细胞类型的"转录指纹"，研究细胞分化，探索疾病或环境因素导致的细胞组成变化等。
单细胞测序的经典流程：分离单细胞（核），将RNA转换为cDNA，准备测序文库（illumina）后测序。
SMART-seq2是一种低通量单细胞测序法，提供全长转录组的定量，适合研究小细胞组（如差异isoform使用，低表达转录本的特征）。
10x Chromium是一种高通量方法，使用UMIs进行定量，适合研究高度异质组织和大量的细胞样本。
1.单细胞 RNA-seq：单细胞RNA测序介绍
在人体组织中，细胞类型、状态和相互作用是非常多种多样的。为了更好地了解这些组织和存在的细胞类型，scRNA-seq提供了对在单个细胞水平上的基因表达
这种前沿方法可用于：
scRNA-seq是解决一些更常见研究的流行方法，主要包括：
在 scRNA-seq 之前，转录组分析是使用 Bulk RNA-seq ，这是一种直接比较 细胞表达平均值的 方法。如果想要查看比较转录组学（例如来自不同物种的相同组织的样本）或者在疾病研究中量化表达特征，这种方法可能是一个不错的选择。如果您 不期望或不关心 样本中的 细胞异质性 ，它还具有发现疾病生物标志物的潜力。
虽然Bulk RNA-seq 可以探索不同条件（例如**或疾病）之间基因表达的差异，但无法充分捕获到细胞水平的差异。例如，在下图中，如果进行Bulk分析（左），我们将无法检测到基因 A 和基因 B 表达之间的正确关联。但是，如果我们按细胞类型或细胞状态对细胞进行正确分组，我们可以看到基因之间的正确关联。
尽管 scRNA-seq 能够在细胞水平上捕获表达，但样本生成和文库制备更加昂贵，而且分析 更加复杂且难以解释 。scRNA-seq 数据分析的复杂性包括：
我们将在下面更详细地探讨每一个复杂性：
来自 scRNA-seq 实验的表达数据代表了数千个细胞的数万或数十万个读数。数据输出要大得多，需要更多的内存来分析、更大的存储需求和更多的时间来运行分析。
对于基于液滴的 scRNA-seq 方法，测序深度较浅，通常每个细胞只能检测 10-50% 的转录组。这导致细胞显示许多基因的计数为零。然而，在特定细胞中，基因的零计数可能意味着该基因 没有被表达， 或者只是 没有检测到 转录本。在细胞中，表达水平较高的基因往往具有较少的零。由于这个特性，许多基因在任何细胞中都不会被检测到，基因表达在细胞之间会有很大的变化。
生物学差异的无用来源可能导致细胞之间的基因表达比实际生物细胞类型/状态更相似/不同，这可能会掩盖细胞类型的标识。
生物学差异的无用来源（除非实验研究的一部分）包括：
技术差异来源可能导致细胞间的基因表达因技术差异而变的更加相似或不同，而不是生物细胞的类型/状态变化造成的，这会模糊细胞类型的一致性。
技术差异的来源包括：
如果其中有 任何 答案是 'No' ，那么就有批次效应。
关于批次的做好做法：
虽然scRNA-seq是一种 功能强大且有见地 的可以从单细胞水平分析基因表达的方法，但仍 存在许多挑战和变异来源 ，这可能会使数据分析变得复杂或有限。
总体而言，我们建议关注以下内容：
参考文献：
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